當前位置 > 首頁 > 新聞動態 > 科研動態
成都生物所在新的基因敲降工具方面研究獲進展
更新日期: 2019-03-21 作者: 黄鑫 文章來源:天然藥物室
打印 文本大小:    

 錘頭狀核酶HHRz是一種能夠催化RNA剪切反應的功能核酸大分子,可在特定的位置對底物RNA進行剪切。目前,核酶作爲基因治療工具已應用于癌症、退行性疾病以及病毒性疾病的基因治療研究中。其中將HHRz作爲基因敲降工具治療艾滋病的臨床二期研究結果表明,錘頭狀核酶是非常安全的基因敲降工具,由于其不需要任何蛋白分子的協助,核酶能夠通過兩結合臂(binding arm)特異性識別目標RNA序列,同時在特定的位置將RNA鏈切開,到目前爲止沒有其脫靶現象的報道,因此在基因治療中具有獨特的優勢。但是目前廣泛使用的天然錘頭狀核酶,在體內是用于催化RNA自身剪切,當應用于分子間的RNA剪切時其活性大大的下降,從而導致其基因敲降的效率低于其他的分子工具,如幹擾RNA 

 中國科學院成都生物研究所功能生物大分子和生物检测学科组发展了一个全新的核酶细胞内分子间筛选策略:以一个毒性蛋白(IbsC)爲報告基因,在大腸杆菌中通過核酶對其mRNA的剪切來調節毒蛋白的表達——如果核酶活性較低,IbsC可有效表達而導致細菌死亡;當核酶具有較高活性時,毒性蛋白的表達下降細菌則可以在篩選平板上生長出菌落(如圖1A)。因此在錘頭核酶的催化活性中心和突環處引入隨機突變建立篩選文庫(圖1B),經過多輪篩選,通過基于毒蛋白的篩選策略成功獲得多個錘頭核酶突變克隆(圖1C),隨後通過測序獲得了10個具有活性的錘頭核酶突變體。 

   

  1A)核酶的細胞內篩選策略;(B)篩選庫設計;(C)篩選結果。 

 由于基于毒蛋白的筛选体系难于定量分析筛选出来的核酶在细胞内的剪切效率,他们随后设计了一个基于双荧光蛋白的报告体系来定量对比不同核酶之间的剪切效率(圖2A)。用紅色熒光蛋白的基因替換毒蛋白基因作爲報告基因,通過改變核酶的底物結合序列使得核酶靶向紅色熒光蛋白的mRNA,同時融合表達了綠色熒光蛋白的基因作爲內參,可以通過流式細胞儀檢測細菌紅色熒光相對綠色熒光的降低程度來評估核酶在細胞內的敲降效果。雙熒光報告體系結果表明,篩選的核酶中有三個突變體(TX-2TX-5TX-9)比野生型核酶对细胞内的靶基因的敲降效果更好(圖2B),其中TX-2對紅色熒光的敲降效率是野生型核酶的2倍。爲確定核酶對靶基因的剪切是否在不同的RNA序列上的通用性,他們又選擇了紅色熒光蛋白上另外兩個位置進行剪切,TX-2在三个剪切位置对靶基因的敲降效果表现出了稳定一致的高效催化活性(圖2CD)。 

   

  2. 錘頭核酶HHRz對大腸杆菌紅色熒光蛋白基因的敲降 

 由于TX-2是在原核細胞中獲得,隨後考察了TX-2在真核細中的基因的敲降能力: 首先在癌細胞Hela中對比了篩選獲得的核酶對紅色熒光蛋白的敲降效率,結果表明TX-2的敲降效果顯著好于野生型核酶;隨後,以斑馬魚的體細胞色素沈著基因(nacre)为核酶的靶标,研究核酶在动物模型上对特定内源基因的敲降(圖3)。結果表明,注射表達TX-2質粒的斑馬魚與野生型核酶注射的魚相比,體細胞色素沈著明顯減少,RT-PCR的結果也表明TX-2會引起nacre基因在RNA水平上显著减低(圖3A)。又以斑馬魚的尾部發育基因(ntl)爲靶標進一步驗證TX-2的敲降效率,結果表明TX-2比野生型核酶具有更好的靶基因敲降效果(圖3B),注射TX-2核酶導致超過27%的斑馬魚出現典型的無尾表型。這些結果說明TX-2可以作爲一個有效的工具用于細胞內的基因敲降。 

   

  3 ATX-2對斑馬魚紅色熒光蛋白基因的敲降;(B)(CTX-2對斑馬魚nacre基因(控制色素沈著)的敲降;(DTX-2對斑馬魚ntl基因(控制尾部發育)的敲降

 綜上所述,通過體內篩選方法得到的核酶TX-2无论在原核还是在真核细胞内都表现出比野生型錘頭核酶更好的基因敲降效果,说明基于毒蛋白的细胞内筛选体系完全适于催化分子间核酶工具的进化和筛选,同时通过体内筛选获得的活性大大增强的突变型錘頭核酶,目前用腺相关病毒为载体利用,TX-2作爲新的分子工具在癌症的基因治療研究工作已經在該研究團隊展開。 

 

黃鑫博士

 该研究的主体工作由中國科學院成都生物所黃鑫博士完成,整个研究工作历时四年的时间,同时感谢四川大学生物治疗国家重点实验室的莫显明教授和赵永云博士对该研究工作的支持与帮助,该研究结果已发表在2019Nucleic Acids Research IF: 11.561)上。 

 原文鏈接


电话:028-82890289   传真:028-82890288   Email:swsb@cib.ac.cn
邮政编码:610041   地址:中国四川省成都市人民南路四段九号
中國科學院成都生物研究所 ? 版权所有   蜀ICP备05005370号